結(jié)直腸癌（CRC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其主要死亡原因是腫瘤轉(zhuǎn)移。m6A是一種新興的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，METTL3參與了多種癌癥類型的腫瘤進(jìn)展。然而，它在CRC中的作用仍然不清楚。
2019年6月24日，中山大學(xué)腫瘤防治中心徐瑞華課題組在Molecular Cancer（IF10.679）期刊上發(fā)表了題為METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma的重要研究成果。首次證明了METTL3在促進(jìn)CRC進(jìn)展中的作用，并揭示了METTL3促進(jìn)CRC進(jìn)展的m6A-IGF2BP2依賴性機(jī)制，為CRC預(yù)后提供了更具預(yù)測(cè)價(jià)值的新潛在生物標(biāo)志物組合（包括“writer”METTL3、“reader”IGF2BP2和“target”SOX 2）。
METTL3在CRC患者中高表達(dá)，導(dǎo)致SOX2轉(zhuǎn)錄本m6A甲基化水平升高。隨后，甲基化的SOX2被m6A“reader”IGF2BP2識(shí)別，以維持其mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)。最后，SOX2表達(dá)的增加通過(guò)SOX2的下游靶標(biāo)促進(jìn)CRC細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致CRC的進(jìn)展。
??? 首先，采用Western blot、real-time PCR (RT-qPCR)和免疫組化(IHC)檢測(cè)METTL3在細(xì)胞株和患者組織中的表達(dá)。
??? 采用MeRIP-seq和轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序(RNA-seq)篩選METTL3的靶基因。（由銳博生物提供測(cè)序服務(wù)）
??? METTL3體內(nèi)/體外生物學(xué)功能研究。
??? 采用RNA pull-down和RNA免疫沉淀法研究靶基因的特異性結(jié)合。并采用RNA穩(wěn)定性分析檢測(cè)METTL3下游基因的半衰期。
1、METTL3在轉(zhuǎn)移性CRC中高表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)
研究人員為了評(píng)估CRC中m6A WERs ( writers, erasers，readers )的表達(dá)譜，通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)METTL3、YTHDF1、YTHDF2、IGF2BP1、IGF2BP2在CRC腫瘤組織中顯著增加。其中METTL3在大多數(shù)人類癌癥中普遍高表達(dá)，因此本研究探索了METTL3在CRC中的功能和臨床意義。發(fā)現(xiàn)METTL3在復(fù)發(fā)性CRC組織和轉(zhuǎn)移性肝組織中持續(xù)升高，并且METTL3 mRNA和蛋白水平在CRC細(xì)胞系和CRC患者組織中明顯增加。
隨后，研究人員探索了METTL3與CRC的臨床意義，IHC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)原發(fā)性CRC組織中METTL3染色增加。同樣，METTL3在匹配的淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移灶中也顯著升高。并且發(fā)現(xiàn)METTL3高表達(dá)的患者從標(biāo)準(zhǔn)化療中獲益較差。此外，METTL3高表達(dá)的CRC患者總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(DFS)均較短，表明METTL3表達(dá)可以作為CRC患者OS和DFS的預(yù)后標(biāo)志物。
2、SOX2受METTL3介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)節(jié)
為了研究METTL3在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用，研究人員首先注意到分別從單個(gè)患者的腹部轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)腫瘤分離出的SW620和SW480細(xì)胞系表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)移能力，并且與SW480細(xì)胞相比，SW620細(xì)胞中的METTL3水平升高，這表明METTL3與轉(zhuǎn)移之間存在一定的聯(lián)系。因此，研究人員對(duì)SW480、SW620和METTL3敲低的SW620細(xì)胞進(jìn)行MeRIP-seq（由銳博生物提供）和RNA-seq，發(fā)現(xiàn)與SW480細(xì)胞相比，SW620細(xì)胞中有733個(gè)高甲基化的m6A峰，其mRNA表達(dá)水平較高，稱為轉(zhuǎn)移相關(guān)的超高峰；METTL3敲低的SW620細(xì)胞中有3393個(gè)低甲基化m6A峰，其mRNA表達(dá)較低，稱為METTL3相關(guān)的低下峰。兩組峰共同擁有192個(gè)特定峰，對(duì)應(yīng)158個(gè)基因，主要富集在干細(xì)胞分化通路，說(shuō)明該通路可能受METTL3調(diào)控，通過(guò)m6A機(jī)制促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。
接著，從m6A-seq數(shù)據(jù)中篩選了4個(gè)干細(xì)胞分化通路中的基因：SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2。基因特異性m6A pull down實(shí)驗(yàn)和qPCR分析表明：與SW480細(xì)胞相比，SW620細(xì)胞中SOX2、ZFP36L2和SEMA3A的m6A水平增加。然而，與對(duì)照組相比，在METTL3敲低CRC細(xì)胞中，SOX2表現(xiàn)出最一致的m6A和mRNA水平的下降。此外，在SW620和HCT116細(xì)胞中，METTL3抑制后，SOX2蛋白水平顯著降低?？紤]到SOX2被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤發(fā)生和參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要CSC標(biāo)志物，推測(cè)METTL3以m6A依賴性方式促進(jìn)CRC的干性和轉(zhuǎn)移，從而維持SOX2的表達(dá)。
3、METTL3在體外促進(jìn)CRC細(xì)胞的干性
為了驗(yàn)證以上推測(cè)，研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3抑制的SW620和HCT116細(xì)胞中的球體數(shù)量和大小減少、干細(xì)胞發(fā)生率顯著降低，細(xì)胞集落形成和侵襲能力也受到損害。并且METTL3敲低的SW620和HCT116細(xì)胞對(duì)基于奧沙利鉑的化療敏感性增加。此外，還發(fā)現(xiàn)METTL3抑制后，CSC表面抗原如CD133、CD44、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)在SW620和HCT116細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低。SOX2下游基因CCND1、MYC和POU5F1的表達(dá)在METTL3敲低的SW620和HCT116細(xì)胞中被一致地抑制。從而揭示了METTL3的致癌作用，特別是在促進(jìn)CRC細(xì)胞的腫瘤自我更新、細(xì)胞侵襲和化療耐藥方面。而在METTL3敲低和對(duì)照CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SOX2則可使球體形成增加，并出現(xiàn)明顯的化療耐藥表型。表明METTL3通過(guò)維持CRC中SOX2的表達(dá)，在促進(jìn)干細(xì)胞特性方面發(fā)揮了重要作用。
4、METTL3在體內(nèi)驅(qū)動(dòng)CRC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
接下來(lái)，研究人員通過(guò)皮下異種移植試驗(yàn)以確定METTL3在體內(nèi)的功能。發(fā)現(xiàn)植入METTL3敲低的SW620和HCT116細(xì)胞時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)速度較慢，異種移植腫瘤重量減少。此外，與尾靜脈注射METTL3敲低細(xì)胞的小鼠相比，注射對(duì)照SW620細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出更多的肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。值得注意的是，在METTL3敲低的SW620細(xì)胞中，致瘤性CRC細(xì)胞的發(fā)生率顯著降低。此外，SOX2過(guò)表達(dá)增加了對(duì)照和METTL3敲低SW620細(xì)胞中腫瘤發(fā)生率和致瘤細(xì)胞的頻率。表明METTL3通過(guò)維持CRC中的SOX2表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移灶的形成。
隨后，通過(guò)兩種PDX模型來(lái)評(píng)估METTL3通過(guò)腫瘤內(nèi)RNAi注射的潛在治療效果。發(fā)現(xiàn)METTL3 siRNA治療組腫瘤體積明顯低于對(duì)照組。此外，分離PDX腫瘤并進(jìn)行IHC染色評(píng)估，發(fā)現(xiàn)METTL3 siRNA治療組中METTL3、SOX2和EpCAM表達(dá)的染色減少。進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了METTL3在體內(nèi)CRC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的重要作用。
5、IGF2BP2通過(guò)m6A依賴性方式增強(qiáng)SOX2 mRNA穩(wěn)定性
為了闡明SOX2的特異性m6A readers，并確定SOX2調(diào)節(jié)的m6A依賴性機(jī)制，研究人員通過(guò)RNA pull-down來(lái)篩選SOX2相關(guān)的m6A readers。發(fā)現(xiàn)IGF2BP2在SW620和HCT116細(xì)胞中特異性地結(jié)合了SOX2全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。值得注意的是，IGF2BP2主要結(jié)合于SOX2 CDS區(qū)域，且在m6A motif缺失后，特異性結(jié)合受到顯著損害。RIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了IGF2BP2和SOX2 mRNA直接相互作用。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)IGF2BP2和SOX2表達(dá)正相關(guān)，暗示其潛在的正向調(diào)控機(jī)制。隨后，研究人員通過(guò)siRNA抑制IGF2BP2后，發(fā)現(xiàn)SOX2蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低，且SOX2下游基因的表達(dá)也降低。此外，抑制METTL3可導(dǎo)致IGF2BP2和SOX2轉(zhuǎn)錄本之間的直接相互作用受損。
此外，研究人員評(píng)估了METTL3或IGF2BP2抑制的CRC細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞中的RNA衰變速率。發(fā)現(xiàn)當(dāng)METTL3或IGF2BP2抑制時(shí)，SOX2 mRNA表達(dá)開(kāi)始降低并且SOX2 mRNA半衰期持續(xù)顯著縮短。表明甲基化的SOX2轉(zhuǎn)錄本被m6A“reader”IGF2BP2（可保持轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性以防止其降解）直接識(shí)別，并通過(guò)m6A-IGF2BP2依賴性機(jī)制自然地增加其表達(dá)。
6、CRC中METTL3、SOX2和IGF2BP2的臨床相關(guān)性
最后，為了探索METTL3、IGF2BP2和SOX2的臨床相關(guān)性，研究人員通過(guò)IHC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRC組織中SOX2和IGF2BP2表達(dá)均顯著升高，Kaplan-Meier生存分析表明高表達(dá)SOX2和IGF2BP2與較短的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期時(shí)間顯著相關(guān)。值得注意的是，SOX2在CRC組織中的表達(dá)與METTL3和IGF2BP2呈正相關(guān)。此外，METTL3或IGF2BP2表達(dá)與SOX2下游基因CCND1、MYC、POU5F1也呈正相關(guān)。采用Cox回歸分析METTL3、SOX2和IGF2BP2均顯著增加了死亡的危險(xiǎn)比(HR)，表明這三個(gè)基因是獨(dú)立的預(yù)后因素。
接著，研究人員生成一個(gè)含有METTL3、SOX2和IGF2BP2的新IHC panel來(lái)預(yù)測(cè)CRC的預(yù)后。Kaplan-Meier生存分析表明，具有三種高表達(dá)標(biāo)志物的患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期最短。此外，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)與任何單個(gè)標(biāo)記相比，新IHC panel（METTL3、SOX2和IGF2BP2）顯示出總體生存率的可加性預(yù)測(cè)值。
總之，該研究結(jié)果顯示了作為致癌基因的METTL3通過(guò)CRC細(xì)胞中的m6A-IGF2BP2依賴性機(jī)制維持SOX2表達(dá)，并且揭示了一個(gè)用于CRC預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物組。
原文：Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m 6 A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 112.
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