專門針對皮膚炎癥復發(fā)，浙大團隊研發(fā)可溶性微針貼片，結合基因編輯改善耐藥性問題
炎癥性皮膚?。↖nflammatory skin disorders，ISDs）是臨床當中最為常見的一種頑疾，這些疾病大多是皮膚上皮屏障對過敏原和病原體產生的炎癥反應。
代表性疾病包括銀屑病、特應性皮炎（atopic dermatitis，AD），由此引發(fā)的全身或局部紅斑、多層銀白色鱗屑及不同程度的瘙癢，常常反復發(fā)作，經久不愈，這不僅極大地影響了美觀，還會給患者的生理及心理帶來巨大的影響，讓人苦不堪言。
然而，當下供患者選擇的獲批治療方案寥寥無幾。其中，外用糖皮質激素和免疫抑制劑是當前的主流治療方式，如臨床常用的藥物地塞米松。但大多數(shù)患者在用藥后，治療效果往往難以達到預期，尤其是長期使用極易產生耐藥問題。
“我們一直在考慮，如何通過藥物制劑的手段來提高糖皮質激素的敏感性，以有效改善糖皮質激素的治療效果?！?浙江大學藥學院教授，博士生導師平淵表示。
近日，平淵團隊創(chuàng)新性地提出了通過基因編輯的治療手段，并結合可溶性微針（microneedle，MN）技術，選擇性靶向敲除與耐藥相關的 NLRP3 基因，可顯著改善銀屑病及特應性皮炎的治療效果。換句話說，NLRP3 基因編輯和糖皮質激素治療相結合（通過 MN 介導的透皮給藥）有望成為治療 ISDs 的一種潛在有效策略。
該研究成果于 3 月 10 日發(fā)表在《科學進展》（Science Advances）雜志上，標題為《微針輔助基因編輯：一種通過 CRISPR-Cas9 靶向 NLRP3 基因的透皮策略用于協(xié)同治療炎癥性皮膚疾病》（Microneedle-assisted genome editing: A transdermal strategy of targeting NLRP3 by CRISPR-Cas9 for synergistic therapy of inflammatory skin disorders）。
圖 | 相關論文（來源：Science Advances）
可溶性微針制備：膠原三肽、透明質酸為基體材料
以往研究表明，NLRP3 炎癥小體（nod-like receptor family, pyrin domain–containing 3）激活后會增加免疫相關細胞的糖皮質激素的耐藥性。由于其存在皮膚的表皮及真皮層，這就意味著，目前研發(fā)靶向 NLRP3 炎癥小體的相關藥物很難透過皮膚吸收，抑制其活性，最終治療效果也時常不盡人意。
為了進行有效給藥，平淵及其團隊選擇了一種更加強效、直接的破局之路 —— 研發(fā)了專門用于治療 ISDs 可溶性微針貼片，可以直接透過皮膚角質層等屏障，在表皮及真皮層降解釋放并遞送基因編輯藥物制劑，從而達到高效治療的目的。
圖 | 基因編輯蛋白（Cas9）和糖皮質激素地塞米松（Dex）經皮和細胞內的分級遞送示意圖（來源：Science Advances）
“這項研究工作從開始到完成一共耗費了約兩年的時間，前期的困難主集中于透皮制劑的制備與優(yōu)化，以及如何修復炎癥引起皮膚損傷組織?！?平淵說道。
MN 貼片的設計包含三個組成部分：
（1）聚合物 / Cas9 核糖核蛋白（RNP）納米復合物，用于 Cas9 的胞內遞送，靶向 NLRP3 炎性小體；
（2）地塞米松（Dex）負載的聚合物納米粒子，用于改善糖皮質激素治療；
（3）含有 Cas9 納米復合物和 Dex 納米顆粒的可溶性 MN 貼片，用于經皮共給藥。
具體而言，MN 貼片是通過微模塑的方法從生物相容性的透明質酸（hyaluronic acid，HA）和膠原三肽（collagen tripeptide，CTP）的水溶液中制備的。制備的 MN 陣列貼片的尺寸為 8 mm × 8 mm，15 × 15 的 MN 陣列。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，MN 為錐體，基底直徑為 200 μm，高度為 600 μm，形貌完整、均勻。
研究發(fā)現(xiàn)，CTP 濃度從 0 增加到 10% 時會對 MN 的剛度產生影響。含 10% CTP 制成的 MN 貼片的機械強度為 1.5 N / 針，高于不含 CTP 的 MN 貼片（0.9 N / 針）。
此外，含 10% CTP 的 MN 貼片與含 20% CTP 的 MN 貼片在機械強度上沒有顯著差異。這樣制備出的 MN 貼片具有優(yōu)異的力學性能，擁有足夠的剛度確保皮膚的插入和滲透。然而當 CTP 含量從 10% 增加到 30% 時，MN 表面的粗糙度發(fā)生了明顯的變化。
因此，平淵團隊選擇 HA 和 10% CTP 作為基體材料，制備出的 MN 貼片不僅具有良好的生物相容性，還能促進膠原合成，減少經皮水分流失，促進皮膚病變的組織修復。因此，可溶性 MN 貼片可以極大地促進這兩種納米制劑的透皮給藥。
圖 | 雙載 MN 系統(tǒng)的物理性能（來源：Science Advances）
可溶性微針可持續(xù)給藥，顯著改善炎癥表現(xiàn)
為了研究 MN 貼片在體內的降解水平，平淵團隊分別評估了羅丹明（rhodamine，一種紅色熒光染料）和標記異硫氰酸熒光素（FITC，一種綠色熒光染料）的基因編輯蛋白 Cas9 分別從從聚乳酸 – 羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）及 Cas9 載體中的釋放行為。
將 MN 貼片插入到小鼠皮膚后，發(fā)現(xiàn) MN 能迅速吸收皮膚中組織液并迅速溶解，同時能夠觀察到羅丹明和 Cas9-FITC 在表皮和真皮區(qū)域的分布情況。這些結果表明 Dex 和 Cas9 蛋白質納米制劑在體內的持續(xù)性釋放，證明 MN 貼片可以作為一個藥物儲庫，在皮膚內能夠持續(xù)釋放治療藥物。
圖 | 雙載 MN 系統(tǒng)的皮膚穿透及釋放情況（來源：Science Advances）
為了評估 MN 貼片對皮膚炎癥的治療作用，他們首先將 2,4 – 二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）涂在裸露的背側皮膚上，造成典型的病變，如皮膚干燥、嚴重紅斑、出血、瘢痕、水腫、抓痕、糜爛等，從而建立 AD 小鼠模型，然后在局部連續(xù) 5 周涂敷 MN 貼片。
實驗證明，負載 CP/Ad-SS-GD/ Cas9 或 PLGA/Dex 的 MN 貼片能夠適度緩解 AD 癥狀，其療效與市面使用的 Dex 乳膏或他克莫司軟膏相當。而雙載 MN 貼劑（載有 RNP 和 DEX）的抗炎能力最強，小鼠皮膚的水腫、出血、紅斑、抓痕和侵蝕明顯減輕。
此外，在連續(xù)使用 MN 貼片治療 5 周后，可以觀察到小鼠背部的毛發(fā)再生。在治療期間，使用 MN 貼劑治療的小鼠沒有記錄到顯著的體重減輕，這表明在未來的臨床轉化中其具有較好的安全性。
瘙癢是 AD 的主要癥狀，夜間睡眠時，瘙癢會加劇，從而嚴重影響了生活質量。在 AD 模型小鼠中，后肢抓撓與瘙癢感相關，瘙癢緩解作為 AD 恢復的標志，是判斷治療是否成功的關鍵指標。與對照組相比，他們發(fā)現(xiàn)負載 Cas9 RNP 或 Dex 的 MN 貼片均能顯著減輕 AD 小鼠的抓撓行為。
正如預期的那樣，由于 NLRP3 基因破壞和糖皮質激素治療的協(xié)同治療作用，雙載 MN 貼劑對瘙癢表現(xiàn)出最強的抑制作用。經過臨床評分，發(fā)現(xiàn)采用雙載 MN 貼片治療后，小鼠皮炎的嚴重程度明顯降低，這說明 MN 貼片在治療 AD 時的優(yōu)異性能。
圖 | 雙載 MN 貼片緩解 DNCB 誘導的 AD 癥狀（來源：Science Advances）
“目前臨床常用的治療牛皮癬和特應性皮炎的制劑為地塞米松乳膏及他克莫司軟膏。與這兩款制劑相比，我們的優(yōu)勢在于通過微針技術高效通過皮膚的角質層屏障。此外，可溶性微針含有膠原三肽，可以促進皮膚損傷組織的與膠原合成，促進皮損組織的修復?！?平淵指出。
談及此次研究的應用場景與產業(yè)化趨勢，平淵表示，此次研發(fā)的微針貼皮未來可應用于感染性皮膚病，如痤瘡、皮膚真菌病等；其他病原體感染相關皮膚病以及其他自身炎癥性皮膚病，比如自身免疫性表皮下蕁麻疹；皮膚因紫外光照射而老化的癥狀，以及皮膚醫(yī)美相關的場景。
并強調道，目前已有一些高新科技生物公司在對微針技術轉化及產業(yè)化進行了大量臨床前研究，他們相信這種技術在未來會有廣闊的前景和市場。
利用基因編輯手段，突破炎癥性皮膚病治療的核心難題
除了選用可溶性微針直接給藥之外，該研究另外一大巧妙之處就在于利用了第三代基因編輯 CRISPR/Cas9 技術，直接精準敲除了 NLRP3 基因，有效降低了 NLRP3 炎癥小體的表達。
通過基于 CRISPR-Cas9 的基因編輯對 NLRP3 炎癥小體的直接破壞，不僅可在 DNA 水平上抑制了 NLRP3 的激活，而且避免了如小分子抑制劑常見的脫靶效應。
他們最近開發(fā)的聚合載體使 Cas9 RNP 能夠在細胞內高效遞送，確保了 NLRP3 基因在皮下角質形成細胞和免疫細胞中的高效基因組編輯。
同時，NLRP3 炎癥小體的破壞可以進一步提高糖皮質激素治療的敏感性。由于 Dex 在其入核過程中能夠誘導核孔擴張，因此它在細胞內的遞送將同時有助于基因組編輯劑的核進入。
平淵告訴 DeepTech，其課題組一直致力于基因編輯遞送載體的研發(fā)及相關疾病的治療，也一直在探索是否可以利用基因編輯技術來解決炎癥性皮膚病的治療。同時，在浙江大學藥學院顧臻教授課題組微針貼片在透皮給藥制劑方面的工作，以及華南理工大學王均教授課題組在炎癥小體敲除后治療炎癥性疾病的啟發(fā)之下，他們最終決定嘗試利用課題組自己研發(fā)的基因編輯遞送載體，結合微針給藥技術，來治愈炎癥性皮膚病。
之所以選擇利用基因編輯手段進行醫(yī)藥研究，與平淵個人的研究背景密切相關，更與研究團隊成員的集體努力分不開關系。
圖 | 可溶性微針雙載貼片研究人員：左一平淵，中間萬濤，右一潘齊（來源：受訪者）
平淵在新加坡攻讀博士期間主要從事基因遞送的載體研究，并關注非病毒載體在基因治療方面的應用。但那時候基因治療方興未艾，并未有突破性的技術進展。
直到 2012 年以 CRISPR/Cas9 為基礎的基因編輯技術問世，并迅速拓展至基因治療領域，彼時的他正在新加坡南洋理工大學從事博士后研究，當時曾有意識地關注基因編輯領域的動向。
2015 年被新加坡南洋理工大學聘為資深研究員，主要從事仿生蛋白作為藥物遞送載體的研究。直到 2017 年 10 月以浙江大學 “百人計劃” 引進人才的身份加盟浙江大學，并組建自己的研究小組，自此正式開始主攻基因編輯遞送技術及疾病治療。
而目前，他感興趣的領域是基因編輯非病毒載體，并在疾病與基因治療中的應用。由于病毒病毒載體存在安全性和免疫原性的問題，如最近有報道慢病毒載體在治療地中海貧血患者出現(xiàn)了嚴重的安全性問題，如急性髓細胞白血病及骨髓增生異常綜合癥，所以他們將目光轉移到非病毒載體的研究，提高非病毒載體的安全性，并兼顧其有效性。
下一階段，他們希望通過研發(fā)出安全的非病毒基因載體，針對一些罕見病，如苯丙酮尿癥及酪氨酸血癥，展開治療研究。
來源：麻省理工科技評論
