蛋白功能的發(fā)揮需要其在不同構(gòu)象之間進行轉(zhuǎn)變。雖然目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)對蛋白結(jié)構(gòu)的解析已經(jīng)能夠達到原子分辨率，但所獲得的蛋白結(jié)構(gòu)仍主要以占比較高的低能態(tài)為主。蛋白在功能發(fā)揮的過程中存在一些瞬時的、高自由能的亞態(tài)，獲取關(guān)于這些亞態(tài)的信息對于充分理解蛋白作用機制具有重要意義，但目前的技術(shù)手段在捕捉這些瞬時結(jié)構(gòu)上仍存在局限性。
2022年3月2日，布蘭迪大學(xué)Dorothee Kern課題組于Nature發(fā)表題為Structure determination of high-energy state in a dynamic protein ensemble的研究論文，通過結(jié)合NMR假接觸化學(xué)位移 (pseudocontact chemical shift, PCS) 和Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 弛豫彌散 (PCS-CPMG) 對蛋白瞬時的高能態(tài)進行結(jié)構(gòu)解析，同時確定了蛋白在功能發(fā)揮過程中伴隨構(gòu)象變化而產(chǎn)生的動力學(xué)或熱力學(xué)改變。利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)-肽度TIMEDOO
相比于X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡，NMR在解析蛋白高能態(tài)結(jié)構(gòu)中具有一定的優(yōu)勢，通過核極化效應(yīng) (nuclear Overhauser effect, NOE)、殘留偶極耦合 (residual dipolar coupling, RDC)、順磁弛豫增強 (paramagnetic relaxation enhancement, PRE) 及PCS等對結(jié)構(gòu)進行進一步約束，可以使所獲得的結(jié)構(gòu)信息更為準(zhǔn)確1-3。但在實際應(yīng)用NMR解析高能態(tài)結(jié)構(gòu)時仍存在諸多困難，譬如，化學(xué)位移雖曾被用于解析小蛋白（小于150個氨基酸）的高能態(tài)結(jié)構(gòu)，但在將化學(xué)位移與結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)時仍存在較大的不確定性4。本文所使用的方法主要依賴于PCS，能在結(jié)構(gòu)解析時提供長程的約束。PCS定義為反磁化學(xué)位移與順磁化學(xué)位移之間的差值，相比于化學(xué)位移能提供更多的三級結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)域之間的信息。此外，PCS與弛豫彌散的偶聯(lián)，使得彌散效應(yīng)更顯著且可調(diào)控。

腺苷酸激酶 (adenylate kinase, Adk) 的構(gòu)象變化與其酶促反應(yīng)周期密切相關(guān)，其低能態(tài)的閉合狀態(tài)在晶體結(jié)構(gòu)中已被解析，但高能的活化狀態(tài)的存在只被間接證實。利用PCS-CPMG，研究人員發(fā)現(xiàn)Adk催化核心及AMP lid部分表觀PCS的變化更大，提示高能態(tài)中ATP lid和AMP lid處于開放狀態(tài)，且這一開口的大小實際小于此前的認知5（圖1）。

利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)-肽度TIMEDOO
圖1. Adk在催化過程中的不同狀態(tài)及其在順磁和反磁
情況下的彌散狀態(tài)
對實驗獲得的1HNCPMG數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在高能狀態(tài)下，AMP lid開口大約為15°，與閉合狀態(tài)更為相似。由于實驗中ADP濃度為飽和狀態(tài)，這一高能態(tài)的結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)是被底物或產(chǎn)物完全占據(jù)的，因而這一結(jié)構(gòu)較好地揭示了Adk為產(chǎn)物的釋放做準(zhǔn)備的過程（圖2），解釋了底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放過程中的構(gòu)象選擇及誘導(dǎo)-適應(yīng)。利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)-肽度TIMEDOO
圖2. Adk高能態(tài)的結(jié)構(gòu)及其在催化反應(yīng)中的構(gòu)象變化
不同于Adk，大多數(shù)蛋白不具備順磁金屬結(jié)合的位點，為了證明PCS-CPMG這一方法在蛋白高能態(tài)結(jié)構(gòu)的研究中具備一定的普適性，作者進一步在鈣調(diào)蛋白 (calmodulin) 和Src激酶的模擬數(shù)據(jù)中對這一方法進行測試。對于calmodulin來說，可以采用鑭系金屬替代其所結(jié)合的Ca2+，而對于Src激酶來說，可以引入能夠結(jié)合鑭系金屬的分子標(biāo)簽，通過這樣的策略，PCS-CPMG的使用范圍得到了拓展（圖3）。
利用NMR解析蛋白高能態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)-肽度TIMEDOO

?圖3. PCS-CPMG在其他蛋白中的應(yīng)用，左圖為calmodulin，右圖為Src激酶

綜上所述，對于分子量在60 kDa以下的蛋白，且高能態(tài)占比低至該蛋白整體的0.5%時，PCS-CPMG在確定高能態(tài)的結(jié)構(gòu)方面具有較大的優(yōu)勢。在未來，隨著方法學(xué)上的進一步優(yōu)化，蛋白不同構(gòu)象結(jié)構(gòu)的解析應(yīng)當(dāng)會變得更加便捷。
原文鏈接
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04468-9
參考文獻
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4.Nerli, S., McShan, A. C. & Sgourakis, N. G. Chemical shift-based methods in NMR structure determination. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 106-107, 1–25 (2018).

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來源： 結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心