2023年10月2日，北京大學深圳研究生院全軍民教授團隊聯(lián)合中山大學卜憲章教授團隊在Nature Communications在線發(fā)表了題為“Development of cyclopeptide inhibitors of cGAS targeting protein-DNA interaction and phase separation”的研究論文，這項研究通過靶向PPIs（蛋白質-蛋白質相互作用）環(huán)肽庫的體外篩選，鑒定出一類新型cGAS環(huán)肽抑制劑。聯(lián)合團隊通過分子模擬、體外生化實驗以及細胞實驗驗證了該抑制劑靶向cGAS和dsDNA之間的蛋白質-DNA界面，破壞dsDNA和cGAS之間的相互作用，進一步抑制dsDNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）。同時，優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內抑制了單純皰疹病毒-1（HSV-1）誘導的抗病毒免疫反應，并增強了HSV-1感染。此外，XQ2B顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平的升高以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。這項工作為突破現(xiàn)有cGAS抑制劑臨床應用的局限性提供了新的思路，也為自身免疫及自身炎癥性疾病的治療提供新的策略。

論文發(fā)表封面

cGAS-STING信號通路是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。cGAS作為異常胞漿DNA的重要傳感器，在病原體入侵和細胞應激時被活化并進一步激活下游銜接蛋白STING（干擾素基因刺激因子），進而啟動先天免疫反應。cGAS通過誘導干擾素刺激基因（ISG）的表達，在抗病毒反應和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關鍵作用。相反，cGAS-STING通路的異常激活已被證明是自身免疫性和自身炎癥性疾病的關鍵發(fā)病機制。TREX1是負責降解胞質DNA的核酸外切酶，其功能缺失突變導致胞質dsDNA的積累和cGAS-STING途徑的異常激活，隨后引發(fā)自身免疫性疾病如Aicardi-Goutières綜合征（AGS）或凍瘡性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）。此外，各種細胞損傷引起的線粒體DNA應激也通過觸發(fā)cGAS活性促進炎癥反應。cGAS在先天免疫和自身炎癥反應中的重要作用支持cGAS作為cGAS活性異常相關疾病的潛在藥物靶點。

近年來，人們致力于開發(fā)強效和特異性cGAS抑制劑，靶向cGAS活性位點的多種化學支架的cGAS抑制劑已通過高通量篩選試驗發(fā)現(xiàn)，并通過藥物化學進行了優(yōu)化。與傳統(tǒng)的蛋白質配體結合口袋不同，蛋白質-DNA界面的溶劑暴露、高正電荷和平坦的特性使開發(fā)具有類藥物性質的小分子抑制劑具有挑戰(zhàn)性。大環(huán)肽已被證明是調節(jié)蛋白質-蛋白質相互作用（PPIs，開發(fā)小分子抑制劑的具有挑戰(zhàn)性的界面）的有效工具，因為它們具有高效力和選擇性，因此大環(huán)肽成為調節(jié)蛋白質-DNA界面的潛在骨架。

為了從大環(huán)肽庫中篩選靶向蛋白質-DNA界面的cGAS抑制劑，作者應用了一種基于RNA的熒光生物傳感器來檢測2’，3′-cGAMP，用于體外篩選cGAS活性抑制劑，并通過細胞實驗進一步篩選驗證。在體外蛋白水平和細胞水平測定中苗頭分子（hits）之間的抑制活性差異可能歸因于它們不同的細胞滲透性，作者鑒定出XQ2在細胞測定中具有最佳cGAS抑制活性，并進一步驗證了XQ2特異性抑制人源和鼠源細胞中dsDNA誘導的cGAS活化和cGAS-STING信號傳導。接下來，作者在體外通過表面等離子體共振（SPR）、微量熱泳動（MST）以及熒光偏振（FP）等技術分析表明XQ2與GAS直接結合，并阻斷cGAS與DNA的相互作用。值得關注的是他們的數(shù)據顯示胞內高濃度的ATP/GTP顯著促進XQ2與cGAS的結合親和力（K_d= 4.5 ± 1.6 μM vs K_d= 45.3 ± 26.9 μM），該作用模式與目前報道的cGAS抑制劑活性因胞內ATP/GTP競爭而減弱顯然不同。作者進一步結合分子對接及定點突變闡明XQ2與cGAS的潛在結合模式。

XQ2與cGAS結合并阻斷cGAS-DNA相互作用

DNA誘導的cGAS液液相分離（LLPS）在調節(jié)酶活性和先天免疫信號傳導中起著至關重要的作用。鑒于XQ2對dsDNA與cGAS結合的抑制作用，作者進一步在體外蛋白水平和細胞水平驗證了XQ2以劑量依賴的方式有效抑制DNA誘導的cGAS液液相分離。

XQ2抑制DNA誘導的cGAS液液相分離

為了評估XQ2B的臨床應用價值，作者利用自身免疫性疾病模型——Trex1^-/-小鼠，進一步驗證了XQ2B顯著抑制了Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子的表達水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，表明XQ2B有效地減輕了Trex1^-/-小鼠的全身炎癥，突出了靶向蛋白質-DNA界面的cGAS特異性抑制劑在cGAS相關自身免疫性疾病中的治療潛力。

XQ2B抑制Trex1^-/-小鼠的全身炎癥

總之，這項研究通過體外生化實驗、分子模擬、細胞實驗和動物實驗等技術手段，成功鑒定出一類全新作用機制的cGAS環(huán)肽類抑制劑，靶向蛋白質-DNA界面，并阻斷DNA誘導的cGAS液相縮合和活化。一種優(yōu)化的類似物XQ2B在體外和體內抑制HSV-1誘導的抗病毒免疫反應，并顯著抑制Trex1^-/-小鼠原代巨噬細胞中I型干擾素和促炎細胞因子水平以及Trex1^-/-小鼠的全身炎癥。XQ2B作為首例靶向蛋白-DNA界面及液液相分離的特異性cGAS抑制劑，為進一步開發(fā)cGAS相關自身免疫性和自身炎癥性疾病藥物提供新的思路。

北京大學深圳研究生院博士研究生王小權和中山大學博士研究生王尤橋為該論文的并列第一作者，全軍民和卜憲章為該論文的共同通訊作者。為本文作出貢獻的作者還有：北京大學深圳研究生院博士研究生曹安琪、羅欽宏博士、李勤凱博士，遵義醫(yī)科大學陳道遠博士，浙江大學博士研究生趙瑋琦、許軍博士。該研究得到了國家自然科學基金、深圳市科技創(chuàng)新計劃項目、深圳基礎研究計劃項目和廣東省基礎與應用基礎研究基金項目的支持。

來源：北京大學深圳研究生院