阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease）簡稱AD，亦稱老年癡呆癥，是當今世界范圍內患病最廣泛，病情最嚴重的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為記憶缺失、運動功能障礙，最后腦功能嚴重喪失直至死亡。隨著年齡的增加，該疾病的發(fā)病概率逐漸增大，統(tǒng)計表明，在65歲以上人群中，其發(fā)病率高達10%，在85歲以上人群中，發(fā)病率更是達到30-50%。然而到目前為止，該疾病沒有任何特效藥物，預防方法和治療手段都嚴重不足，給病人及其家人造成極大的痛苦，也為社會帶來沉重的負擔。AD病人的特異性標志物之一是腦組織中出現(xiàn)的淀粉樣斑塊沉積，它是由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP, amyloid precursor protein）被γ-分泌酶（γ-secretase）切割后產生的Aβ多肽逐漸聚集形成的。γ-分泌酶是由四種亞基Presenilin1（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin（NCT）共同組成的膜內蛋白酶復合物。遺傳學證據(jù)表明，可遺傳的家族性AD所攜帶的基因突變中有200多個突變位于編碼γ-分泌酶活性亞基PS1的基因上。一直以來，抑制γ-分泌酶的切割活性，減少淀粉樣斑塊沉積都是一個重要的治療AD的策略，很多針對AD藥物的研發(fā)直接以γ-分泌酶作為靶點，希望通過調節(jié)其活性來治療疾病，一些藥物也曾進入臨床II期或III期試驗。非常遺憾的是，這些藥物竟無一例外地宣告失敗，AD藥物研發(fā)領域倍受挫折。
禮來公司研發(fā)的小分子藥物Semagacestat是最為著名的案例：Semagacestat是第一個進入臨床三期試驗的γ-分泌酶抑制劑，該小分子藥物由于其前期試驗的顯著效果倍受關注；但是臨床三期試驗結果顯示，該藥物并未延緩疾病發(fā)展，而且還會導致患者認知能力和日?；顒幽芰p弱。除此之外，Semagacestat還會提高病人患皮膚癌的風險，這很有可能是由于這種抑制劑不僅抑制APP的切割，還抑制了γ-分泌酶另外一種重要底物—Notch的切割，因此合理地設計對APP和Notch具有底物選擇性的γ-分泌酶抑制劑具有重要的價值。然而一直以來γ-分泌酶與其小分子藥物的原子分辨率結構的缺失使得進一步的藥物設計與優(yōu)化面臨著很大的困難。
2020年12月28日，結構生物學高精尖創(chuàng)新中心施一公教授團隊在國際著名學術雜志《Cell》（細胞）上在線發(fā)表《小分子藥物抑制及調節(jié)γ-分泌酶的結構基礎》（Structural Basis of γ-Secretase Inhibition and Modulation by Small Molecule Drugs）的文章[1]，第一次報道了γ-分泌酶結合三種小分子抑制劑（Gamma-Secretase Inhibitor, GSI）和一種調節(jié)劑（Gamma-Secretase Modulator, GSM）的四個原子分辨率冷凍電鏡結構，闡明了γ-分泌酶識別不同種類抑制劑及調節(jié)劑的分子機理?？蒲腥藛T通過與2015年解析的γ-分泌酶的結構，以及2019年γ-分泌酶分別結合底物Notch與APP兩種狀態(tài)進行比較分析，首次完整展現(xiàn)了γ-分泌酶結合底物與藥物的全過程，為了解γ-分泌酶活性調節(jié)機制提供了前所未有的精準藍圖，也將極大地推進下一代γ-分泌酶抑制劑及調節(jié)劑的設計與優(yōu)化。
失敗是成功之母，只有明白了為什么失敗，才能積累經(jīng)驗，通向成功。在該研究中，施一公教授課題組首先解析了γ-分泌酶與Semagacestat的3.0??分辨率結構。Semagacestat在γ-分泌酶中與底物結合γ-分泌酶所形成的β-strand占據(jù)著相同的位置，對底物進入γ-分泌酶活性中心形成了位阻。值得一提的是，底物Notch與APP所形成的β-strand均會被Semagacestat阻礙，這一結果成功地解釋了Semagacestat抑制γ-分泌酶活性的機制，也一目了然地說明了Semagacestat產生副作用的機制。接下來的研究中，解釋對APP和Notch具有一定選擇性的抑制劑如何結合γ-分泌酶，對于開發(fā)或優(yōu)化特異性抑制劑意義重大。施一公教授課題組選擇了進入到臨床II期由BMS公司研發(fā)的Avagacestat進行研究，成功解析了γ-分泌酶結合Avagacestat的3.1 ?的結構。出乎意料的是，Avagacestat也占據(jù)著底物的β-strand的位置，但是在與PS1的具體相互作用方面與Semagacestat有所不同。Avagacestat主要與PS1的疏水殘基存在相互作用，只形成了一個氫鍵，而Semagacestat可以形成四個氫鍵。結合Avagacestat與結合Semagacestat后的PS1的構象有一定區(qū)別，呈現(xiàn)出更為“松散”的狀態(tài)，Avagacestat的底物選擇性或許和這些相互作用形式的不同有關。
Semagacestat和Avagacestat都是γ-分泌酶抑制劑中的非過渡狀態(tài)類似物（non-transition state analog，non-TSA），除此之外，還有過渡狀態(tài)類似物（transition state analog，TSA）抑制劑。為了更全面的闡述所有類型抑制劑的作用機理，他們進一步解析了γ-分泌酶結合TSA抑制劑L685,458的的結構。在γ-分泌酶研究領域，L685,458具有獨特的地位，因為很多用于研究γ-分泌酶構象變化的化學工具都是L685,458的衍生物。意料之中，L685,458的一部分也具有與前面兩種抑制劑相同的空間占位。不同之處在于，L685,458 還可以與γ-分泌酶的兩個天冬氨酸催化殘基存在直接相互作用，清楚的捕捉到了天冬氨酸水解酶催化過程中形成“正四面體”中間態(tài)的構象。
至此，該研究成功揭示了三種不同的γ-分泌酶抑制劑的作用機理，分析了其共同點，更重要的是揭示了三者之間的區(qū)別，為未來優(yōu)化和設計具有底物特異性的抑制劑奠定了堅實基礎。
然而抑制機理的研究只是γ-分泌酶活性調節(jié)的一個環(huán)節(jié)，在以γ-分泌酶為靶點的小分子藥物設計領域，還有另一類不容忽視的小分子，即γ-分泌酶活性調節(jié)劑（GSMs）。γ-分泌酶調節(jié)劑（GSMs）在AD藥物的研發(fā)方面也具有很大的潛力。與GSI不同的是，GSMs并不完全抑制γ-分泌酶切割活性，而是一定程度上促進毒性較強的Aβ42的進一步切割，形成更為安全的Aβ38等更短的多肽，緩解淀粉樣斑塊的形成。因此GSMs或許可以輔助GSIs以達到更優(yōu)的切割效率和底物選擇性。E2012是一種雜環(huán)類化合物，它可以和L685,458同時結合γ-分泌酶達到更高的抑制效果。該研究中展示了γ-分泌酶和E2012、L685,458的冷凍電鏡結構，分辨率高達2.6 ?。E2012像一把匕首，一側插入到PS1和NCT共同形成的結合空腔中，這也是首次明確了γ-分泌酶結合GSM的位點。E2012結合后可以和PS1的loop1形成氫鍵，loop1與γ-分泌酶的底物也存在相互作用。對比底物結合的構象，E2012空間上對底物跨膜螺旋的一側具有一定的位阻效應，但不完全重合，這與抑制劑是有明顯區(qū)別的。這種位阻效應，客觀上構成了底物跨膜螺旋兩個方向的運動趨勢，為解釋E2012促進Aβ42切割成Aβ38的別構調節(jié)機制提供了結構基礎。
γ-分泌酶結合三種小分子抑制劑（Semagacestat、Avagacestat和L685,458）和一種調節(jié)劑（E2012）的原子分辨率冷凍電鏡結構。三種小分子抑制劑結合在相同的位置，占據(jù)底物β-strand的位置，與PS1的β-strand相互作用。調節(jié)劑E2012結合在另外一個別構調節(jié)位置。施一公教授實驗室一直以來都將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機理作為重點研究方向，其中與AD相關的重要蛋白γ-分泌酶的三維結構及其作用機理的解析是一項重要的環(huán)節(jié)。2012年，施一公教授及其團隊在Nature上發(fā)表文章報道了PS1的同源蛋白PSH的晶體結構[2]。2014-2015年，先后在Nature報道了分辨率為4.5 ?以及3.4 ?人源γ-分泌酶的三維結構，第一次報道了人源γ-分泌酶的冷凍電鏡三維重構結構，并分析了γ-分泌酶中催化亞基PS1上的致病突變[4]。2019年，經(jīng)過近五年的不懈努力，分別在Nature和Science發(fā)表論文報道了γ-分泌酶結合重要底物Notch和淀粉樣前體蛋白APP的冷凍電鏡結構，分辨率達到了2.7 ?和2.6 ?，這兩篇文章為理解γ-分泌酶特異性識別并切割底物的分子機制提供了重要基礎[5,6]。此次發(fā)表在Cell上的研究是在之前研究基礎上γ-分泌酶結構領域的又一次進步與突破，為開發(fā)以γ-分泌酶為靶點的特異性藥物提供了極為重要的基礎。結構生物學高精尖創(chuàng)新中心施一公教授是該研究論文的通訊作者。原清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者，現(xiàn)中國農業(yè)大學教授楊光輝、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越青年科學家周瑞、清華大學生命學院三年級博士生郭雪飛為論文的共同第一作者。清華大學高精尖創(chuàng)新中心的研究員閆創(chuàng)業(yè)博士參與了本項工作，清華大學冷凍電鏡平臺的雷建林博士對數(shù)據(jù)收集進行了指導。國家蛋白質科學中心（北京）清華大學冷凍電鏡平臺和清華大學高性能計算平臺分別為該研究的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理提供了支持，冷凍電鏡平臺的李曉敏博士、楊帆博士對數(shù)據(jù)收集提供了幫助。北京市結構生物學高精尖創(chuàng)新中心（清華）、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、浙江省重點研發(fā)計劃為該研究提供了經(jīng)費支持。
1. Li, X., Dang, S., Yan C., Gong, X., Wang, J., Shi, Y. (2013). Structure of a presenilin family intramembrane aspartate protease. Nature 493, 56–612. Lu, P., Bai, X.C., Ma, D., Xie, T., Yan, C., Sun, L., Yang, G., Zhao, Y., Zhou, R., Scheres, S.H.W., and Shi, Y. (2014). Three-dimensional structure of human gamma-secretase. Nature 512, 166-170.
3.?Bai, X.C., Yan, C., Yang, G., Lu, P., Ma, D., Sun, L., Zhou, R., Scheres, S.H.W., and Shi, Y. (2015b). An atomic structure of human gamma-secretase. Nature 525, 212-21
4.?Yang, G., Zhou, R., Zhou, Q., Guo, X., Yan, C., Ke, M., Lei, J., and Shi, Y. (2019). Structural basis of Notch recognition by human gamma-secretase. Nature 565, 192-197.
5.?Zhou, R., Yang, G., Guo, X., Zhou, Q., Lei, J., and Shi, Y. (2019). Recognition of the amyloid precursor protein by human gamma-secretase. Science 363.
來源：結構生物學高精尖創(chuàng)新中心
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