2022年11月9日，北京大學生命科學學院高寧教授課題組于Nature Communications在線發(fā)表了題為“Structural dynamics of AAA?+?ATPase Drg1 and mechanism of benzo-diazaborine inhibition”的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術解析了多種核苷酸狀態(tài)下的Drg1結構，以及底物結合狀態(tài)下的六聚體結構，基于高分辨結構和生化數(shù)據(jù)分析詳細的闡明了Drg1發(fā)揮功能的分子機制。同時，本研究還解析了藥物Benzo-diazaborine（B-Dia）結合狀態(tài)下Drg1六聚體的高分辨率結構，揭示了該藥物的作用分子機制。

核糖體是蛋白質翻譯的場所，是將遺傳信息由mRNA傳遞為蛋白質氨基酸序列的加工廠。真核生物核糖體組裝是一個高度復雜、精密且又耗能的過程，涉及rRNA的轉錄、加工與成熟；核糖體蛋白的翻譯和轉運；多種核糖體組裝因子的結合和解離等過程。核糖體最初的組裝發(fā)生在核仁中，然后核糖體前體被運送到核質和細胞質，并在細胞質中完成最后的成熟。在真核生物細胞中，有超過200種核糖體組裝因子參與此過程，其中包括三種分別定位于核仁、核基質以及細胞基質中的AAA+ ATPases (ATPases associated with a variety of cellular activities)—Rix7，Real和Drg1。其中Drg1在酵母中為必須基因，其人源中的同源蛋白SPATA5與精子的發(fā)生密切相關。SPATA5的突變會導致癲癇、聽力障礙或智力障礙等疾病的發(fā)生。當前體60S核糖體（pre-60S）從細胞核經(jīng)核孔復合物轉運到細胞質中后，Drg1結合到pre-60S上，啟動了核糖體在胞質中的成熟過程，并釋放了核糖體組裝因子Nog1，Rlp24，Tif6和Mrt4等核糖體組裝因子。有研究報道，Rlp24的C端結構域通過與Drg1相互作用，增加其ATPase活性；并且Drg1釋放組裝因子這一過程可能需要輔助蛋白（Adaptor/co-factor）的參與。Drg1的生物學活性可以被硼雜環(huán)化合物diazaborine（Benzo-diazaborine）抑制，導致pre-60S在胞質中的積累，而引起細胞功能紊亂。但是，迄今為止，Drg1完整的、高分率的結構未知，其轉運底物的詳細分子機制不明，抑制劑的結合位點和作用機理不清。

基于高分辨結構，該研究解析了Drg1的高分辨結構。研究發(fā)現(xiàn)與其他經(jīng)典的II型AAA+ ATPase類似，由NTD，D1和D2形成三層結構，并形成同源六聚體發(fā)揮功能。有趣的是，Drg1的NTD雖在序列與Cdc48/p97同源性較低，其三維結構卻是高度相似的；這從結構上也提示著，Drg1在發(fā)揮功能時可能也需要將底物蛋白徹底解折疊成多肽。在底物結合狀態(tài)下的Drg1六聚體結構中，Drg1蛋白的保守結構域Walker A、Walker B、Sensor I、Sensor II、arginine finger（AF）、pore loops I 和II (PL-I和PL-II)、ISS等都清晰可見。Drg1的D1和D2通過保守的Pore-loop（PL）芳香族氨基酸殘基圍繞著底物，并且呈螺旋階梯式上升，每個PL像是一個抓住底物的手，以“Hand-over-hand”的方式進行底物的轉運。Drg1的六個亞基（P：protomer）中，P1-5通過PLs與多肽底物發(fā)生相互作用，而P6遠離底物，且D2的核苷酸結合口袋是空的?；趯Y構的分析推測Drg1的作用機制如下：當P6結合ATP后，會重新結合底物，繼而轉變?yōu)镻1的狀態(tài)；同時，P5結合的ATP會水解成ADP，轉變?yōu)镻6的狀態(tài)，并遠離底物，Drg1以此模式周而復始的進行底物的去折疊和轉運。結構顯示Drg1保守的ISS（Inter-subunit signaling）motif參與了相鄰亞基間的協(xié)同作用以及通過其構像變化調控ATPase活性。結合ATP后，鄰近protomer的ISS會由螺旋構象（Helical conformation）轉變?yōu)槿切蔚膌oop（Triangular loop），并伸向核苷酸結合口袋；同時，ISS的構象變化和PLs與底物的結合和解離相偶聯(lián)。遺傳數(shù)據(jù)也表明ISS、D1-D2之間的linker和PLs的突變均會影響核糖體的組裝效率和細胞的生長。

圖1. 底物結合狀態(tài)的Drg1結構

Diazaborine最初被發(fā)現(xiàn)為一種抗菌化合物，能阻礙脂肪酸和磷脂的生物合成，從而防止細菌增殖。Diazaborine能夠抑制Drg1的ATPase活性，從而導致穿梭蛋白在pre-60S上的積累，影響pre-60S的成熟。在解析的B-Dia結合的Drg1六聚體結構中，可以清晰的看到12個ATP/B-dia結合在D1和D2的核苷酸結合口袋中。B-Dia與ATP分子中核糖的2’-OH形成共價鍵，抑制了ATP的水解，將Drg1鎖在一個較平、對稱的結構，從而阻斷了D1和D2的構象變化和功能的執(zhí)行。

圖2. B-Dia結合狀態(tài)下的Drg1冷凍電鏡結構

綜上所述，該研究工作解析了不同核苷酸狀態(tài)下的Drg1六聚體結構，詳細的闡明了不同核苷酸狀態(tài)下的Drg1六聚體構象變化。解析了底物處理過程中的Drg1六聚體結構，闡述了Drg1底物轉運的詳細分子機制。對深入理解Drg1在核糖體大亞基的成熟過程中所發(fā)揮的作用具有重要意義。該文章的結構和功能數(shù)據(jù)表明Drg1很可能通過發(fā)揮蛋白質解折疊酶（unfoldase）的活性，而不是解聚酶（disassemblase），來參與核糖體大亞基的組裝。

高寧為該論文的通訊作者，課題組馬成英博士（現(xiàn)為昌平實驗室副研究員）、吳大木博士研究生（2017級PTN）為本文的共同第一作者，實習生陳倩同學（現(xiàn)就讀于浙江大學）在該工作中亦有貢獻。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃、啟東-SLS創(chuàng)新基金、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、膜生物學國家重點實驗室的支持。北京大學冷凍電鏡平臺、電鏡實驗室、高性能計算平臺、生命科學學院儀器中心及鳳凰工程等多個儀器平臺對本項目提供了重要的技術支撐。

來源：北京大學