2021年6月21日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心魏文勝課題組在Nature Biotechnology在線發(fā)表題為“Genome-wide interrogation of gene functions through base editor screens empowered by barcoded sgRNAs”的研究論文。

論文截圖

基于CRISPR-Cas的功能性篩選技術(shù)為基因功能研究和藥物靶點發(fā)現(xiàn)提供了有力手段。經(jīng)典的CRISPR敲除篩選方法依賴于Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂。然而，DNA雙鏈斷裂的產(chǎn)生如果修復(fù)不及時會造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。因此，Cas9靶向基因組多拷貝位點時極易引起細(xì)胞死亡，從而影響基因功能篩選的準(zhǔn)確性。此外，在對基因組損傷更為敏感的原代細(xì)胞中，基因編輯產(chǎn)生的DNA切割會激活p53信號通路，從而引起細(xì)胞周期停滯乃至細(xì)胞死亡，使得在細(xì)胞中進(jìn)行大規(guī)模篩選比較困難。例如，在有野生型p53表達(dá)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中，經(jīng)典CRISPR基因敲除篩選呈現(xiàn)出信噪比過低的結(jié)果；在人多能干細(xì)胞中，對單個基因組位點的編輯也同樣容易造成細(xì)胞死亡。近期，多篇報道針對如何在原代細(xì)胞中實現(xiàn)大規(guī)?；蚪M功能性篩選的技術(shù)方案展開爭論和探討，但始終沒有令人滿意的解決方案。

針對上述問題，魏文勝課題組發(fā)展了名為iBARed cytosine Base Editing-mediated gene KnockOut （BARBEKO）的新型篩選方案。該方法利用胞嘧啶單堿基編輯器，通過靶向破壞蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子位點或剪接位點，或通過引入提前終止密碼子的方式來實現(xiàn)非依賴DNA雙鏈斷裂的高效基因敲除。結(jié)合實驗室之前建立的內(nèi)置分子條形碼（iBAR）設(shè)計sgRNA（Zhu et al. Genome Biology 2019），BARBEKO方案可以依賴高病毒感染復(fù)數(shù)建庫，在提升篩選效率的同時，極大減少了所需細(xì)胞數(shù)量。相較于經(jīng)典的CRISPR基因敲除篩選，BARBEKO方法能將篩選所需細(xì)胞量降低10-100倍，并能夠通用于正向和負(fù)向選擇篩選，可以大幅提升全基因組水平功能性篩選的可行性與經(jīng)濟性。

BARBEKO方法在多種癌細(xì)胞系和表達(dá)野生型p53的正常細(xì)胞中實現(xiàn)了準(zhǔn)確、高效的細(xì)胞適應(yīng)性（fitness）篩選。該方法能有效避免基因拷貝數(shù)效應(yīng)，有效降低負(fù)向篩選中與細(xì)胞死活相關(guān)的高假陽性率；在對DNA雙鏈斷裂敏感的細(xì)胞系中，該方法在篩選精度和準(zhǔn)確率方面優(yōu)勢尤為明顯（下圖）。這些結(jié)果表明，BARBEKO方法為原代細(xì)胞、類器官或模式動物體內(nèi)等復(fù)雜生物模型的高通量篩選提供了更優(yōu)的選擇，為數(shù)量受限的細(xì)胞樣品（如病人來源的細(xì)胞）提供了高效篩選方案，因此是基因功能和臨床前研究的有力工具。

BARBEKO篩選策略有效提升基因敲除篩選效率和準(zhǔn)確性

北京大學(xué)魏文勝課題組博士生許萍、劉志恒博士、劉瑩博士和博士生馬華崢為該論文共同第一作者。該研究項目得到國家自然科學(xué)基金重點項目、北京市科委生命科學(xué)前沿創(chuàng)新培育項目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的支持。

來源：北京大學(xué)